Связь между анализом связывания сперматозоидов, гиалуронана человека и скоростью оплодотворения при обычном оплодотворении

ПРЕДПОСЫЛКИ: Анализ связывания сперматозоидов с гиалуронаном (HBA) является одним из коммерческих наборов, продаваемых для рутинного тестирования зрелости и фертильности сперматозоидов. Тем не менее, нет сообщений о том, может ли HBA предоставить дополнительную информацию по стандартному анализу спермы для оплодотворения сперматозоидов. Целью данного исследования было изучить взаимосвязь между ГБА и уровнем оплодотворения при обычном ЭКО. Методы. В исследование было включено 175 пациентов с ЭКО с осеменением ≥3 зрелых ооцитов. Как стандартный анализ спермы, так и HBA выполнялись на тех же пробах эякулированной спермы, которые использовались для лечения ЭКО. Отношения между анализом спермы и результатами ГБА и уровнем оплодотворения были проанализированы с помощью теста Спирмена и многомерного логистического регрессионного анализа. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ: Как общая, так и прогрессирующая подвижность сперматозоидов и нормальная морфология были тесно связаны с показателями HBA. Хотя как нормальная морфология сперматозоидов, так и баллы HBA были статистически значимо связаны с частотой оплодотворения, HBA был менее значимым, чем нормальная морфология сперматозоидов. HBA не предоставляет дополнительную информацию для выявления пациентов с низким уровнем оплодотворения. ЗАКЛЮЧЕНИЕ: ГБА в значительной степени коррелирует с подвижностью и морфологией сперматозоидов, но менее значим, чем морфология сперматозоидов, в отношении скорости оплодотворения при ЭКО. Таким образом, клиническая прогностическая ценность ГБА для оплодотворения сперматозоидов HBA был менее значимым, чем нормальная морфология спермы. HBA не предоставляет дополнительную информацию для выявления пациентов с низким уровнем оплодотворения. ЗАКЛЮЧЕНИЕ: ГБА в значительной степени коррелирует с подвижностью и морфологией сперматозоидов, но менее значим, чем морфология сперматозоидов, в отношении скорости оплодотворения при ЭКО. Таким образом, клиническая прогностическая ценность ГБА для оплодотворения сперматозоидов HBA был менее значимым, чем нормальная морфология спермы. HBA не предоставляет дополнительную информацию для выявления пациентов с низким уровнем оплодотворения. ЗАКЛЮЧЕНИЕ: ГБА в значительной степени коррелирует с подвижностью и морфологией сперматозоидов, но менее значим, чем морфология сперматозоидов, в отношении скорости оплодотворения при ЭКО. Таким образом, клиническая прогностическая ценность ГБА для оплодотворения сперматозоидовв пробирке ограничено.

Введение

Традиционный анализ спермы, включая концентрацию сперматозоидов, подвижность и морфологию, широко используется в качестве основного показателя мужской фертильности. Однако результаты не дают точной диагностической или прогностической информации о фертильности человека ни in vivo, ни in vitro ( Mahadevan and Trounson, 1984 ; Zaini et al ., 1985 ; Jeulin et al ., 1986 ; Silber, 1989 ; Liu and Baker, 1992a ; Специальная группа по андрологии ESHRE, 1996 ; Всемирная организация здравоохранения, 1999 ; Guzick et al ., 2001). Мужчины могут быть диагностированы как стерильные, если их эякуляты постоянно не содержат сперматозоидов, или все неподвижные сперматозоиды, или все сперматозоиды с однородными морфологически структурными дефектами, такими как сперма с круглой головкой без акросомы ( Lalonde et al ., 1988 ; von Bernhardi et al ., 1990) ; Bourne et al ., 1995 ; Baker, 2001). Но в клиниках бесплодия это редкие причины тяжелого мужского бесплодия. У большинства мужчин, страдающих бесплодием, нормальное или пониженное количество сперматозоидов, подвижность или морфология по отдельности или в сочетании. Около одной трети бесплодных мужчин часто имеют неизменно нормальные результаты анализа спермы, и они обычно классифицируются как имеющие необъяснимое бесплодие. Клинически, эти пациенты с необъяснимым бесплодием испытывают трудности с выбором, какая из вспомогательных репродуктивных технологий (АРТ) будет лучшим вариантом, чтобы помочь им достичь беременности с минимальными затратами и менее инвазивной процедурой.

Плохие прогностические значения обычного анализа спермы для оплодотворения спермы не только из-за большого разброса семенных параметров между эякулятами, либо из-за недостаточного или неадекватного контроля качества анализа спермы ( Guzick et al ., 2001 ; Slama et al ., 2002 ; Alvarez et al ., 2003 ; Jequier, 2005 ). Это происходит главным образом потому, что обычный анализ спермы только определяет количество сперматозоидов, их подвижность и морфологию, но не может обнаружить многие другие аспекты функции спермы, такие как зрелость ядра, нормальность ДНК и способность сперматозоидов взаимодействовать с ооцитами ( Liu and Baker, 1992b ; Cayli et al.., 2003 , 2004 ; Huszar et al ., 2003 ). Поэтому были разработаны многие другие специфические тесты сперматозоидов, такие как связывание сперматозоидов zona pellucida, акросомная реакция, вызванная zona pellucida (AR), тесты на зрелость ядер сперматозоидов, повреждение ДНК и скорости сперматозоидов с использованием компьютерного анализа спермы (CASA) ( Burkman et al. , 1988 ; Liu et al ., 1988 ; Liu и Baker, 1992a ; Специальная группа по интересам Андрологии ESHRE, 1996 ; Oehninger et al ., 1997 , 2000 ; Agarwal and Said, 2003 ; Liuи др ., 2004 ; Virro et al ., 2004 ; Sifer et al ., 2005 ). Хотя эти новые тесты могут предоставить дополнительную информацию о фертильности сперматозоидов, они отнимают много времени, требуют дорогостоящего оборудования или требуют достаточного количества биологического материала, которого не хватает, например ооцитов человека. Таким образом, только несколько лабораторий с большими клиниками АРТ способны выполнить эти тесты. Большинство клиник АРТ в основном используют регулярный анализ спермы для диагностики и лечения мужского бесплодия.

Недавно был разработан очень простой тест — анализ связывания сперматозоидов с гиалуронаном (HBA) — в качестве коммерческого диагностического набора для оценки зрелости и функции сперматозоидов ( Cayli et al ., 2003 , 2004 ; Huszar et al ., 2003 ). Этот тест основан на предыдущих сообщениях о селективном связывании гиалуроновой кислоты (ГК) со зрелой спермой с интактной акросомой и лучшей морфологией ( Huszar et al ., 2003 ). Было высказано предположение, что HBA может быть полезным тестом в дополнение к обычному анализу спермы для улучшения клинического диагноза мужского бесплодия или для оказания помощи в клиническом назначении пациентов для лечения с помощью обычного ЭКО или ИКСИ ( Cayli et al.., 2004 ). С тех пор, как диагностический набор HBA стал доступен на рынке, он становится популярным рутинным клиническим тестом во многих клиниках АРТ, в частности в некоторых странах Южной Азии, таких как Китай и Сингапур. Однако, клиническая ценность этого теста не была оценена независимо, и нет никаких предыдущих сообщений о том, может ли HBA предсказать способность к оплодотворению сперматозоидов. Цель этого исследования состояла в том, чтобы определить связь между HBA и результатами обычного анализа спермы и уровнем оплодотворения с помощью традиционного ЭКО у большого числа пациентов.

Предметы и методы

В течение марта-мая 2005 года в это исследование были включены 195 пациентов, проходивших первый цикл традиционного лечения ЭКО в акушерско-гинекологической больнице Чунцина. В нашей клинике большинство пар получали стандартное ЭКО, и только те, у кого была выраженная олигозооспермия (<10 × 10 6/ мл) или тяжелую астенозооспермную (подвижность <25%) сперму лечили ИКСИ. Чтобы свести к минимуму ошибки скорости оплодотворения при меньшем количестве осемененных ооцитов, 20 пациентов с <3 осемененными зрелыми ооцитами были исключены, и только 175 пациентов с ≥3 зрелыми осоцированными ооцитами были включены в окончательный статистический анализ. Зрелость ооцитов определяли во время проверки оплодотворения примерно через 16–18 ч после осеменения. Средний возраст женщин составлял 31 год (диапазон 22–47 лет), а мужчин — 33 года (диапазон 25–47 лет). Пары были бесплодными в среднем около 5 лет, с широким диапазоном от 1 до 20 лет и без четкого диагноза причин бесплодия. Тем не менее, большинство пар ( н = 123) с легкими и умеренными заболеваниями маточных труб и эндометриозом, а остатки представляли собой смесь мужского фактора и необъяснимого бесплодия.

Анализ спермы

Образцы спермы были получены мастурбацией после 2–5 дней воздержания. Одна и та же эякулированная сперма использовалась как для лечения ЭКО, так и для всех тестов спермы в этом исследовании. Все тесты спермы были выполнены после разжижения спермы в течение 2 часов. Концентрацию и подвижность сперматозоидов в сперме определяли стандартными методами ( World Health Organization, 1999). Подвижность сперматозоидов оценивалась путем подсчета 200 сперматозоидов на образец, а прогрессивная подвижность классифицировалась как комбинация результатов оценки подвижности степени А (быстрое развитие) и В (медленное развитие). Морфологию сперматозоидов оценивали на мазках, полученных путем промывки спермы 10 мл 0,9% хлорида натрия для удаления семенной плазмы с целью уменьшения фонового окрашивания. Морфологические слайды окрашивали 2% гематоксилин-эозином Y после того, как мазки фиксировали в 90% этаноле в течение 30 минут. Процент нормальной морфологии сперматозоидов оценивали с использованием строгих критериев ( Kruger et al ., 1988 ; World Health Organization, 1999). Для каждого образца спермы 200 сперматозоидов отбирали по меньшей мере с 10 отдельных полей с использованием масляного погружения с увеличением × 1000 при освещении в ярком поле. Нормальную морфологию сперматозоидов оценивали два независимых наблюдателя, и для статистического анализа использовали среднее из двух результатов. Существовала очень значимая корреляция между двумя результатами морфологии, полученными от двух наблюдателей ( n = 175, Спирман r = 0,930, P <0,001). Средняя разница между двумя результатами составила 1,3% с SD 4%.

Анализ связывания сперматозоидов с гиалуронаном

Коммерческие наборы HBA были приобретены в Biocoat (Форт Вашингтон, Пенсильвания, США), и тест HBA был выполнен в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, 10 мкл спермы (хорошо перемешанного) добавляли в центр камеры HBA и накладывали покровную решетку Cell-Vu без захвата пузырьков воздуха. Покрытие обеспечивало сетку из 100 квадратов (каждый 0,1 мм × 0,1 мм) в пределах круга просмотра. После инкубации предметного стекла в течение 15 минут несвязанные подвижные сперматозоиды и связанные подвижные сперматозоиды подсчитывали в одинаковых квадратах сетки. Для теста HBA подсчитали 400 подвижных сперматозоидов. Процент связывающей гиалуронан спермы рассчитывали, используя связанную подвижную сперму, деленную на сумму связанных и несвязанных подвижных сперматозоидов, подсчитанную в тех же квадратах и ​​затем умноженную на 100.

Когда дублированные тесты HBA были выполнены на тех же самых образцах спермы от 30 отдельных мужчин, были получены аналогичные результаты (80 ± 10 против 80 ± 10%, несущественно). Средняя разница между двумя результатами составила 1,6% с SD 0,97. Тест Спирмена также показал очень значимую корреляцию между двумя результатами ( n = 30, Спирман r = 0,929, P <0,001). Таким образом, HBA был в высокой степени воспроизводимым в том же образце.

Обычные процедуры ЭКО

Для всех пациентов для достижения понижающей регуляции (E 2 <50 пг / мл, LH <5 мМЕ / мл, толщина эндометрия) использовали стандартный длинный протокол подавления лютеиновой недостаточности с агонистом GnRH (декапетил 0,1 мг / ампер, Ferring). ≤5 мм и остановил развитие фолликула), затем использовали гонадотропин 150–450 МЕ / сутки r-FSH (Gonal-F 75 МЕ / Амп, Сероно, Женева, Швейцария). Когда пациенты имели ведущий фолликул со средним диаметром 18 мм плюс два или более дополнительных фолликулов диаметром 17 мм, им давали 10 000 МЕ u-HCG (Profasi, Serono, Geneva, Switzerland). Трансвагинальная аспирация фолликулов под ультразвуковым контролем проводилась через 36 ч после инъекции ХГЧ.

Ооциты (от четырех до пяти) осеменяли 1–1,5 × 10 5 / мл подвижных сперматозоидов, отобранных PureSperm (слои 40 и 80%) в 0,6 мл среды для оплодотворения Quinn (Irvine Scientific, Irvine, CA, USA). Оплодотворение проверяли примерно через 16–18 ч после осеменения, и нормальное оплодотворение определяли как два пронуклеуса (ПН), которые использовались для всех статистических анализов. Все ооциты с одним или тремя ПН были исключены из анализа. Перенос эмбрионов (от двух до трех эмбрионов) проводили на 3-й день отбора яйцеклеток. В нашей программе ЭКО текущая частота имплантации на один перенос эмбриона составляет в среднем 28%.

Статистический анализ

Значимость корреляций между показателями HBA и результатами анализа спермы и показателями оплодотворения была исследована с помощью критерия Спирмена (непараметрического). Множественный регрессионный анализ также использовался для определения того, какие характеристики сперматозоидов наиболее значимо связаны с показателями HBA. Разница в скорости оплодотворения для различных нормальных групп морфологии спермы была исследована с помощью критерия суммы рангов Уилкоксона. Все данные были проанализированы с помощью многомерного логистического регрессионного анализа, чтобы определить, какие результаты теста спермы наиболее независимо связаны с уровнем оплодотворения in vitro .

Полученные результаты

Все результаты теста спермы суммированы в Таблице I , и был широкий диапазон для всех результатов теста спермы, включая HBA. У 175 пациентов с ЭКО в среднем было осеменено девять зрелых ооцитов, и нормальный коэффициент оплодотворения составил 69% (диапазон 0–100%). Были 21% (37 из 175) пациентов с уровнем оплодотворения ≤50%. Несмотря на статистическую значимость баллов по шкале HBA между пациентами со степенью оплодотворения ≤50% ( n = 37) и> 50% ( n = 138), разница была очень небольшой (69 ± 12 против 75 ± 10%, P<0,05). Из 37 пациентов с оплодотворением ≤50%, только 16% (шесть из 37) из них имели низкие показатели HBA (<60%), как рекомендовано производителем, и 84% (31 из 37) из них имели нормальные оценки HBA (> 60 %). Кроме того, у пяти пациентов с нулевым уровнем оплодотворения баллы по шкале HBA составляли 28, 56, 75, 75 и 79% соответственно, и опять же только у двух из них баллы по шкале HBA были ниже 60%.